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文|栗灏漾
2 L+ d3 h+ \5 }9 q0 e6 x 编辑|栗灏漾 , E G) i% ~4 P
前言8 S' ^8 s7 u/ T; Q
在海洋中，捕食者在维持生态系统结构和功能方面发挥着关键作用，其中选择性捕食者对保持生物多样性至关重要。
* p' C) V9 j4 Q1 B% A. @ 大西洋异腹足目是一类重要的选择性捕食者，主要以壳类翼足目为食，它们的壳对生存至关重要，用于保护和游泳。
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然而对于大西洋异腹足目的壳结构和钙化机制了解甚少，目前人类排放的二氧化碳导致海洋酸化速度前所未有，对许多海洋生物产生负面影响。
% I6 ^5 T2 t' i- x 虽然壳类翼足目受到广泛研究，但大西洋异腹足目对酸化的敏感性却被忽视，大西洋异腹足目可能是最易受OA影响的群体之一，因为它们的壳由方解石构成，而方解石在海水中容易溶解。
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过去的全球变化危机中大西洋异腹足目幸存下来，表明它们可能比预期更具抵抗OA的能力。
% F6 F+ |' U' {3 k* r8 O. V* T4 _ 本研究通过生长和OA实验以及转录组分析，探讨大西洋异腹足目壳体生长和OA响应，揭示了它们作为OA哨兵物种的潜力，并为了解其在海洋化学变化中的角色提供了重要的见解。
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面对海洋酸化，大西洋螺幼年生态环境适应的挑战
% c# F1 n" R2 _, O3 R- w 选择用大西洋螺的草食幼年阶段来做实验，虽然大西洋螺在成年阶段对生态的影响更大。
, v0 [% u( x+ g" `1 {! F: o( | 这么做有几个原因，首先软体动物的早期生命阶段对海洋酸化特别敏感，随着酸性条件的增加，它们的生长和代谢会受到影响。
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: y0 r6 d8 k7 \- | v5 @3 y 希望在这个关键的生命阶段观察它们对海洋酸化的反应，其次，幼年个体可能还没完全长大，所以在实验中它们还有可能进行钙化，但成年个体就不一定了。
% I0 x* S* v0 ^6 z 最后在实验室中养成年大西洋螺会有一些限制，特别是在提供恒定的食物来源方面会很麻烦，而幼年草食阶段很容易提供藻类食物，一旦实验开始后就不用再打扰它们。
X. I# h# i+ q0 n; y; V" C6 n# D 而且幼年大西洋螺可能有时会主动进食，有时会休息，添加了足够几天所需的食物量，以确保在实验条件下它们可以不断进食。
# T. D: x0 f; T L1 k& W" O9 g 采集的A. ariejansseni标本是在RRS Discovery号进行的大西洋纬向断面探测期间在南亚热带交汇区收集的。 8 G4 ^& M( {7 A& K: K" E9 ]
# M( Q8 x* r- j0 \ 在进行这项野外工作时，并不需要获得任何许可或者证明，在35°58S，27°57W采集了生长实验的动物，然后在在41°09S，30°00W采集了海洋酸化实验的动物。 3 T' }4 g6 s' S; J9 \7 o0 O
采样时使用的是1米直径、200微米网孔和带有封闭尾囊的环形网，进行了三次缓慢而短暂的斜拉拖网采集，最大深度不超过100米，所有采样都是在夜间的。 4 n* o% S9 Z' R, e
采集后，立刻用显微镜将A. ariejansseni标本分选出来，然后把它们放入含有荧光素指示剂的液体中，在黑暗中培养了2小时之后，我们用0.2微米过滤的海水轻轻冲洗标本，并把它们放入实验瓶里。 7 \0 b0 m" n5 V# V% z
为了研究海洋碳酸盐化学对大西洋螺钙化的影响，把A. ariejansseni标本放入实验瓶中，进行了为期3天的实验，模拟了现实中近期过去、目前环境和未来近期的pH情景。
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过去的情景设定pH值比目前环境高0.05个单位，相当于1960年代中期的水平；未来的酸化情景设定pH值比目前环境低0.11个单位，相当于预期的2050年南大西洋地区水平。 # ^3 o9 @; ~+ J- q, Z! Q* m( R2 a4 X
所有情景中方解石饱和度都保持在1.82以上，每个处理进行了三次重复实验，并加入了三个对照实验瓶，共计n=12个实验瓶，为了保证每个处理的水质一致，我们在装满实验瓶前对水进行了预处理。 ; ]3 @' v0 a8 ^$ t9 A1 X
从表面海水中0.2微米过滤，放入四个60升的桶中，进行如下处理，在一个桶中，通过通入795 ppm CO2的空气来降低pH值，持续12小时，在另一个桶中，通过通入180 ppm CO2的空气来提高pH值，持续12小时。
3 i$ O, S! m" r2 [- B2 \ 其余两个桶的水作为环境和对照组，没有进行气体通入，在通气过程中，所有水的温度保持在环境海洋温度，在RRS Discovery号的一个温度控制房间内，保持在14-16°C之间。 ( g/ O% l' |, Q1 _
/ z7 J8 z C! J" a. L, D) G7 U 在12小时通气后，测量了四个桶中的温度、盐度和pH值，并采集了溶解无机碳浓度样品，实验瓶装满处理和环境水，另外三个实验瓶只装满环境水，作为对照组，并且成功进行了水质分析。
$ t- G0 X3 J0 Q' S/ n% u7 w 在实验开始时向每个实验瓶中加入了冻干藻类，浓度为0.6毫克/升，这样可以确保在实验过程中食物不会限制钙化速率。
( O- D; C4 p" S$ _ 藻类只在实验开始时添加一次，以免打扰标本并避免实验海水暴露在大气中，我们添加了高浓度的藻类，以确保实验过程中动物可以随意进食。 0 s A: |& [3 j+ r
随机地将染有荧光素的标本放入实验瓶中，每个处理组分别暴露了90至92个幼年个体，通过外壳形态鉴定，我们确认了A. ariejansseni的标本，并根据大小、帷膜的存在以及没有黑色眼睛色素来识别幼年个体。 " A6 `1 Q/ o) A, O) J* H
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实验瓶密封，无空气空间，立即在室温的恒温房间内孵育，用黑色遮光布覆盖住实验瓶，以保持低光水平，实验瓶进行了3天的孵育，第三天结束时，测量了温度、盐度和pH值，并从所有实验瓶中采集了DIC浓度样品。
1 N$ N( Y: _0 F 将标本从实验瓶中取出，并在显微镜下检查它们是否仍然存活，从每个处理中挑选了20个活体幼年个体，用RNAlater保存并冷冻用于RNA测序分析，其余的标本在液氮中迅速冷冻，并存放在-20°C，等待进一步分析。
~! E) p1 h% q ] 壳体成像揭示海洋酸化对大西洋异腹足目钙化的影响
1 `, ^% \0 Y/ c2 w A 在进行钙化量化时，一种方法是测量实验期间壳体生长的长度，也称为壳体延伸。 + W, n2 i; W1 |4 F
为了测量壳体延伸，在荷兰海洋研究所特克塞尔进行了壳体清洁和荧光成像，我们使用低温氧化器氧化样本，以去除壳体上的有机物质，这样做可以最大程度减少损伤。 ; P" }- F! W7 W
接着用乙醇和超高纯度水轻柔地冲洗样本，并在冷烤箱中烘干，使用Zeiss Axioplan 2显微镜和Colibri光源及滤光片成像样本，得到荧光图像。
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然后使用FIJI软件测量荧光壳的范围，尽管处理壳体时非常小心，但有些壳体的生长边缘被损坏，只能提供壳体延伸的最小值，因此将这些样本从后续分析中排除。
! H' X. l4 p( @1 M 使用光学显微镜检查样本，确认壳体生长边缘是否有损坏，从每个处理中选择14到15个完好无损的样本，使用Zeiss Xradia 520 Versa微CT对这些样本进行扫描。
2 g% _9 b1 k3 L r& i 扫描使用高压电流进行，扫描时间约为2到3小时，扫描分辨率和曝光时间是为了确保获得高质量的扫描图像，通过将荧光图像和微CT厚度图进行手动匹配，分割了壳体，得到实验期间壳体生长的体积和平均厚度，同时还测量了微CT图像以确定壳体的最大直径。
$ Q/ Y: _( b" \& \1 d 为了确定变量之间的相关性，例如壳体厚度和壳体直径之间的相关性，使用了Pearson相关系数。 , i \9 p5 ]' ]9 P
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还制作了Pearson相关系数的配对矩阵，以确认碳酸盐系统参数之间的相关性，使用了一种叫做PERMANOVA的统计方法，来比较OA实验中壳体延伸、壳体厚度和壳体体积等生长测量数据之间的差异，同时还进行了不同处理之间的成对比较。
}# t7 A/ O- ]" I 还使用了t检验来比较OA实验中壳体厚度和原位生长的壳体厚度之间的差异，以及不同食物浓度导致的壳体延伸之间的差异。 : ~9 a/ j+ A) g. d. L1 ^
所有的统计分析都使用PAST v. 4.04软件进行，并设置了显著性水平为p值<0.05。 2 P$ ~8 [4 t+ p7 P4 u
由于阿氏大西洋异腹足幼体体积较小，对每个处理进行了两次样本提取，每次提取8-10个个体，并合并得到总RNA样本。 : m8 v9 Q9 f! q2 ~8 U. Q& ?! h
为了确保有足够的RNA进行下游处理，选择了这种样本取样方式，使用生物分析仪2100和RNA 6000 Nano芯片分析了每个总RNA样本的数量和质量。
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所有样本的RNA质量都很好，可以用于后续的文库制备和测序，使用了NEBNext® Ultra II Directional文库制备试剂盒，根据生产商的方案进行了文库制备，确保了高质量的文库。 6 p) G. ]0 S; x) Z( y* u
测序在BaseClear BV Leiden上的Illumina NovaSeq 6000平台上进行，得到了高质量的测序数据。 - Z2 `9 c* t# M# l( }
基因表达解码：大西洋螺幼年面对全球变化的生态适应机制4 F) _6 r& P; e: ?1 {6 M
在基因表达水平上也观察到了显著的变化，将每个处理中的基因读取与A. ariejansseni的新生转录组参考序列进行对应，以得到转录本和预测基因计数，但由于只有两个生物学重复样本，对差异基因表达的估计要小心解释。
. v; _9 Z3 [4 `) ~7 W 与1960年代中期的环境条件相比，有110个基因显示出差异表达，而与环境条件相比，2050年情况下有49个差异表达基因，其中只有9个基因在这两种处理中是共有的。
5 D% \7 k9 } B- t# F 总体而言差异表达的基因占A. ariejansseni转录组的约0.5%，这在之前关于翼足目动物和桡足类动物对高CO2的转录组反应的研究中是处于相同的范围内的。 ( }5 |3 F' Y$ |- g
进行了GO富集分析，来确定在海洋碳酸盐化过程中哪些分子功能和生物过程被抑制或激活，与pH下降相一致，与蛋白质合成相关的GO类别的基因持续地上调，而与形态发生和有机体发育相关的GO类别的基因下调。 5 z6 o5 U i6 C2 T7 g- o- A+ Z
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类似的差异表达GO类别也在关于翼足目动物的OA研究中被发现，不过响应的方向是相反的，大多数与蛋白质合成有关的基因在高CO2下被抑制，通过对每个差异表达基因进行注释，我们进一步阐明了这些显著转录变化。
, X( v7 D! W: [8 x: ~- { V; b 根据BLAST的转录组注释结果，与碳酸盐化学变化有关的基因大多涉及九个功能类别，包括（1）免疫反应，（2）蛋白质合成，（3）蛋白质降解，（4）生物矿化，（5）碳水化合物代谢，（6）形态发生，发育与神经系统，（7）离子传输，（8）氧化还原以及（9）脂质代谢。
7 m# T3 L! [) a/ }! Q) m! } 热图对比了与蛋白质合成有关的基因的转录水平，结果与GO富集分析的结论相一致，大多数基因在1960年代中期到环境，以及从环境到2050年的情况下上调，即与pH下降的方向一致。 + K. N* P3 w# R$ v
而与形态发生、发育以及神经系统有关的基因的表达模式则更为复杂，一些基因在1960年代中期显著上调，在2050年的处理中有三个基因显著上调。 ; `! W9 B! b' v8 G1 S0 u
( x/ j# {8 }* L" c N2 U4 j' Z5 h( K 涉及氧化代谢的基因表达模式表明1960年代中期和2050年的处理对呼吸产生了影响。特别是，与线粒体相关的两个基因在未来的处理中显著上调。 % j- Y9 F0 \" O
与螺类Limacina retroversa在低pH下线粒体基因的上调模式相一致，但与螺类Heliconoides inflatus中这些基因的下调相矛盾。 l/ U; V7 `2 E! e1 T5 r
与编码含铁血红素蛋白的基因在1960年代中期和2050年的处理中同样上调，而具有氧化还原酶活性的酶则被下调，大量涉及生物矿化的基因在1960年代中期的处理中显著上调，而在环境和2050年的处理中，上调的基因比例较小。
$ J; d; d! J! R 这些生物矿化基因包括编码潜在细胞外壳基质蛋白的基因，例如黏蛋白、类珍珠蛋白以及两种几丁质结合蛋白，同时还包括编码蛋白质和离子运输到生物矿化部位的基因，包括一个钠依赖型转运蛋白和一个钙激活通道调节蛋白。
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+ d4 {- N6 C# r! |9 t9 ?8 J3 m 编码黏蛋白和几丁质结合蛋白的基因在1960年代中期处理中显著上调，而编码珍珠蛋白的基因则在2050年的处理中上调。
, S1 ^' \( D: @7 S" g 大西洋异腹足目是唯一一种有捕食性且壳体由方解石构成的浮游动物。
1 E0 ^& `' M' |2 ~8 k& ] 海洋酸化对它们的壳体生产可能非常敏感，但对它们的钙化机制和对变化中海洋化学的反应了解甚少。
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这项研究中首次对大西洋异腹足目幼体进行了钙化和基因表达方面的研究，研究了它们在不同pH条件下的短期海洋酸化暴露效应，包括：上世纪60年代中期、现今环境和2050年的条件。
& K% R+ s, ~2 s. p 钙化和基因表达的结果显示它们对每种处理的反应都不同，从上世纪60年代中期到现今环境条件下，壳体延伸和壳体体积减少，表明目前南大西洋的钙化已受到限制。 8 y) Z& C- ~% `6 B
结论
( K7 m2 I; n7 M 然而从现今环境到2050年的条件下，壳体延伸却增加了，蛋白质合成相关基因持续上调，而参与生物体发育的基因在pH降低时下调。
8 o/ j+ n9 l' j* _7 ] r 在上世纪60年代中期和2050年的条件下，生物矿化相关基因上调，暗示任何与环境中碳酸盐化学不同的情况都会造成压力，导致壳体快速生长。 ' b5 U2 w+ w5 h7 s
得出结论，未来的海洋酸化很可能会对大西洋异腹足目的钙化产生负面影响。 ( T0 j' Q/ V8 |# S, l* I2 |( K
然而还发现丰富的食物会增加壳体延伸和壳体厚度，因此多重因素可能会影响大西洋异腹足目在酸化海洋中的适应能力。
# c7 }- p% |0 `; G2 m. r" [" V 参考文献
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