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海洋发光细菌和淡水发光菌--吾爱海洋

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发光细菌作为毒性检测的生物学方法,因其简便、快速、灵敏且成本较低而日益受到重视。本试验项目推荐两个方法。一为国家环境保护局于1995年发布的发光细菌法(GB/T15441-1995),采用的是海洋发光细菌菌种;二为淡水发光菌法,采用的是淡水型发光菌种。
+ v5 f) t' |% e; f% W  明亮发光杆菌T3法(A)' P8 ~3 n: e, N  ]  u
  本方法适用工业废水、纳污水体及实验室条件下,可溶性化学物质的水质急性毒性监测。
0 |' T5 [) n! G) I$ A+ h" z  1.原理
( b- C. v+ I4 y6 M) K, O# d. ^7 d  基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关(P≤0.05),因而可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度,以此表示其急性水平。5 C4 {- c# ?5 |: _: M5 @+ z
  水质急性毒性水平可按选用相当的参比物 HgCl2浓度(以mg/L为单位)来表征,或选用EC50值(半数有效浓度,以样品液百分浓度为单位)来表征。1 G3 V8 U+ P1 a- r) C
  2.样品的采集与保存! c( B3 m3 Y1 |3 L3 Z' [# M
  ①采样瓶使用聚四氟乙烯衬垫的玻璃瓶,务必清洁、干燥。采集水样时,瓶内应充满水样不留空气。采样后,用塑胶带将瓶口密封。) P/ A' d1 k% ~" ^0 l) q
  ②毒性测定应在采样后6h内进行。否则应在生化培养箱2-5℃下保存样品,但不得超过24h。报告中应写明水样采集时间和测定时间。
5 `+ J& w" v# T1 Y# ]/ s; Q  ③对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除,以免干扰测定。
# F9 U5 Y5 I. e- Y4 ]9 H  3.仪器设备+ N2 ^% k' L/ S: w. y  @
  ①生物发光光度计:配置2ml或5ml测试管。* I" X: |% Y0 A3 o  E& D
  当 HgCl2标准溶液浓度为0.10mg/L时,发光细菌的相对发光度为50%,其误差不超过±10%。
& S: k$ X: q" y2 z2 S! b5 R  ②2ml或5ml测试样品管(具标准磨口塞,为制造比色管的玻璃料制作,由专业玻璃仪器厂制造),分别适用于相应型号的生物发光光度计。6 Z' P9 H! h3 e  ?% P( R
  ③微量注射器:10μl。
5 W* ]- K& t) p  ④注射器:lml。
3 `2 u% A$ g& {- D+ `9 Z* _- X6 {. B  ⑤定量加液瓶:5ml。
# j( |0 [9 ]3 r2 Q1 ^5 ?  ⑥吸管:2ml、10m1、25ml。. X7 m0 N8 q. b1 E7 v
  ⑦试剂瓶:l00ml。
- _" B9 V; o6 G( l5 ?  ⑧量筒:100ml,500ml。
. e9 \( S2 I+ p6 V* N  ⑨棕色容量瓶:50ml、250ml、1000ml。+ o2 ^! t$ ~0 ~6 H, m; t+ p
  ⑩半微量滴定管(配磨口试液瓶,全套仪器均为棕色):l0ml。
  n2 |( B/ V& I# i. l. ~  ]( t) }  4.试剂和材料
( M" J( f- p5 o5 n  除另有说明外,本方法所用试剂均应为符合国家标准的分析纯试剂、蒸馏水或同等纯度的水。" f. H" Q2 D: B7 \
  ① HgCl2。1 \! v6 `8 ]; e* c. o
  ②氯化钠NaCl,化学纯。
, j# b, h+ S6 a- V  ③明亮发光杆菌T3小种(PhotobacteriumphosphoreumT3spp.)冻干粉,安瓶瓶包装,每瓶0.5g,在2-5℃冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉)密度不低于每克800万个细胞;当按5(3)④步骤将冻干粉复苏2min后即发光(可在暗室内检验,肉眼应见微光),稀释成工作液后每毫升菌液不低于1.6万个细胞((5ml测试管)或2万个细胞(2ml测试管)(均为稀释平板法测定)。在生物发光光度计上测出的初始发光量应在600-1900mV之间,低于600mV允许将倍率调至“×2”档,高于1900mV允许将倍率调整至“×0.5”档。仍达不到标准者,更换冻干粉。
- l4 w$ q' S) [+ s/ p" |9 H% A# c  ④氯化钠溶液,3g/100m1:取氯化钠3g于玻璃容器内,用量筒加蒸馏水l00ml。! F0 O$ E- ~' m6 p
  ⑤氯化钠溶液,2g/l00ml取氯化钠2g,加蒸馏水l00ml于试剂瓶内,2-5℃保存。
4 t# H9 J2 A+ c# {" A9 z9 E5 J# R  ⑥参比物 HgCl2标准溶液:0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.18、0.20、0.22、0.24mg/L。+ v! s7 m9 ^1 ?& {9 D
  ⑦ HgCl2母液,ρ=2000mg/L:1/万分析天平精称密封保存良好的无结晶水 HgCl20.1000g于50ml容量瓶中,用3g/100m1氯化钠溶液稀释至刻度,置2-5℃冰箱备用,保存期6个月。0 y* P+ r! R4 k6 g/ r
  ⑧ HgCl2工作液,ρ=2mg/L:用移液管吸 HgCl22000mg/L母液l0ml于l000ml容量瓶中,用3g/l00ml氯化钠溶液定容。再用移液管吸取 HgCl220mg/L液25ml于250m1容量瓶中,用3g/l00m]氯化钠溶液定容。将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶,然后用3g/l00ml氯化钠溶液,将 HgCl22mg/L溶液按表5-3-6稀释成系列浓度(一律采用50ml容量瓶)。 HgCl2工作液保存期不能超过24h,超过者务必重配。% s: J6 M1 N0 r  e
  5.试验程序" O' ^' D+ t' C' e2 I  R- ^
  (1)稀释样品液
* r" O7 M' Y. ]" _( [  ①样品液测定前稀释的条件:! |* N4 _  Y1 \, c' ?3 k8 |
  样品液预试验:取事先加氯化钠至3g/l00ml浓度的样品母液2m1装入样品管,并设一支CK管(氯化钠3g/100m1溶液),按4②一③所述测定相对发光度。
0 D3 M, E& ~" W- L* ?/ E  若测得的样品,相对发光度低于50%乃至零,欲以EC50表达结果,则需稀释。/ I# T3 M  [9 |( Q( d
  若测得的样品,相对发光度在1%以上,欲以与相对发光度相当的 HgCl2浓度表达结果,则不需稀释。  p  N! R9 n; G5 r- X: P
  ②样品液的稀释液:样品液的稀释液一律用蒸馏水,在定容前一律按构成氯化钠3g/100ml的浓度添加氯化钠或浓溶液(母液只能加固体)。0 y1 b$ I4 i% M/ c
  ③样品液稀释浓度的选择:
2 n  d# Y# y$ a$ l  n  预试验:按对数系列将样品液稀释成五个浓度:100%、10%、1%、0.1%、0.01%(其对数依次为0、-1、-2、-3、-4),按5(2)和5(3)所述粗测一遍,视1%-100%相对发光度落在哪一浓度范围。
! x+ B1 D5 s0 J, M  正式试验:在1%-100%相对发光度所落在的浓度范围内增配到6-9个浓度(例如,若落在0.1%-10%之间,则应稀释成0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%;若落在1%-10%之间,则应稀释成1%、2%、4%、6%、8%、10%),按5(2)-(3)所述再测一遍;这6-9个浓度,也可通过查对数表,按等对数间距原则自行确定(例如,若落在1%-10%之间,则应稀释成10%、6.31%、3.98%、2.51%、1.58%、1.00%其对数相应为1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00,对数间距均为0.2)。
- y1 |* R1 l6 `2 \  (2)测定条件( a/ r( S3 Y. }2 j/ h
  ①室温:20-25℃。
) v# h2 X. e: ^' `- Z- C  同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±1℃,且所有测试器皿及试剂、溶液测前1h均置于控温的测试室内。
( Y  J  f: P( G4 a2 ]  ②pH:若需测定包括pH影响在内的急性毒性,不应调节待测样品pH。3 c7 q( u6 F. v& a
  若需测定排除pH影响在内的急性毒性,需在测定前将待测样品和CK(氯化钠3g/100m1)的pH调至下值:主要含Cu的水样为4.5,主要含其他金属的水样为5.4,主要含有机化合物的水样为7.0。8 h  j2 @* [8 S
  ③溶解氧:本法只能测定包括溶解氧影响在内的急性毒性。
6 X2 G& O# @/ K" G7 v# V  (3)测定步骤7 H0 _2 X1 O) J0 W+ Z. ~! c
  ①试管的排列:于塑料或铁制试管架上按以下两种情况排列测试管。7 C2 p1 U" o/ w9 `- \3 C# z+ H5 g
  a.按5(1)①所述,样品母液相对发光度为1%以上者,如下排列:
: r3 F  s1 @& j/ Y  左侧放参比物 HgCl2系列浓度溶液管,右侧放样品管。前排放 HgCl2溶液和样品管,后一排放对照(CK)管,后二排放CK预试验管。每管 HgCl2或样品液均配一管CK(氯化钠3g/100m1蒸馏水溶液)。设三次重复。每测一批样品,均需同时配置测定系列浓度 HgCl2标准溶液。
. L! {# ~# R' q- K, n. e9 ~3 h  b.按5(1)①所述,样品母液相对发光度为50%以下乃至零者,如下排列:
- \' ?% b+ [7 m% U/ K, J  左侧仅放 HgCl20.10mg/L溶液管(作为检验发光细菌活性是否正常的参比物浓度,其反应15min后的相对发光度应在50%左右),右侧放样品稀释液管(从低浓度到高浓度依次排列)。其他同a。每测一批样品,均需同时配测 HgCl20.10mg/L溶液。1 F* g* o8 v! Y& |* j9 d' K
  ②加3g/l00ml氯化钠溶液:用5ml的定量加液瓶给每支CK管加2m1或5ml氯化钠3g/l00ml(据仪器型号而定)。, z! y* i- \7 {3 Y
  ③加样品液:用2ml或5ml吸管给每支样品管加2ml或5ml样品液(据5(3)②而定)。每个样品号换一支吸管。
" {( `3 h4 d5 q* {2 f0 Y  ④发光细菌冻干菌剂复苏$ y2 a7 J0 j* Z, _9 o
  从冰箱冷藏室2-5℃取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和氯化钠溶液,投入置有冰块1-1.5L保温瓶,用lml注射器吸取0.5m1冷的氯化钠2g/l00m1(适用于5ml测试管)或lml冷的2.5%氯化钠(适用于2m1测试管)注入已开口的冻干粉安瓿瓶,务必充分混匀。2min后菌即复苏发光(可在暗室内检验,肉眼应见微光)。备用。1 A) @6 V1 ?2 }" T. v
  ⑤仪器的预热和调零:打开生物发光光度计电源,预热15min,调零,备用。& N# a/ P& d! X  @$ I/ |  r/ d: q
  ⑧检验复苏发光细菌冻千粉质量:另取一空2m1或5ml测试管加2m1或5ml氯化钠3g/100ml(据5(3)②而定),加10μ1复发光菌液,盖上瓶塞,用手颠倒五次以达均匀。拔去瓶塞,将该管放入各自型号仪器测试舱内,若发光量立即显示(或经过5-l0min上升到)600mV以上,此瓶冻干粉可用于测试,低于者按4③处理。菌液发光量先缓慢上升,约持续5-15min,后缓慢下降,约持续4h。满4h的CK发光量应不低于400mV,低于者更换冻干粉。! A0 X! G9 q5 U2 k
  ⑦给各测试管加复苏菌液:在发光菌液复苏稳定(约0.5h)后,按5(3)所述,从左到右,按 HgCl2或样品管(前)-CK管(后)一 HgCl2或样品管(前)-CK管(后)…顺序,用10μl微量注射器(勿用定量加液器以减少误差)准确吸取10μl复苏菌液,逐一加入各管,盖上瓶塞,用手颠倒五次,拔去瓶塞,放回原位(每管加菌液间隔时间勿短于30s。每管在加菌液的当时务必计时,记录到秒,即为样品与发光菌反应起始时间。立即将此时间加15min,记作各管反应终止(即应该读发光量)的时间。3 D$ T2 i2 q6 e; u# E4 `
  ⑧发光细菌与样品反应达到终止时间的读数:按各管原来加菌液的先后顺序,当某管达到记录的反应终止时间,在不加瓶塞的情况下,立即将测试管放入仪器测试舱,读出其发光量(以光信号转化的电信号一电压毫伏数表示)。
1 [" @: R) \) U. [) u  ⑨有色样品测定干扰的校正:9 x1 Q- q4 P1 M; @
  a.拿掉仪器样品舱上的黑色塑料管口;
9 h6 g) K/ Z8 L% ?% q  b.取-2m1测试管(直径12mm),加氯化钠3g/ml溶液2m1,将该管放进一装有少量氯化钠3g/100m1溶液的5ml管(直径20mm)内,要使外管与内管的氯化钠3g/l00ml液面平齐。此作CK管;
9 X1 `, o  O8 s! T+ S6 q* D7 d! n+ T  c.另取一2ml测试管,加氯化钠3g/ml溶液2ml,放入另一装有少量有色待测样品液的5ml管内,要使外管与内管的氯化钠3g/ml液面平齐。此作CKc管;
7 L6 B" [+ o; Q% b  d.于CK和CKc二管的内管中同时加复苏发光菌液10μ1(注意:必须是本批样品测9 F- J. a$ @- v. F4 Z9 w( Z5 y
  定所用同一瓶复苏菌液),立即记时到秒,等反应满15min,迅速放入仪器测试舱,测定两支带有内管的5ml测试管的发光量。分别记下发光量Ll(CK管)和L2(CKc管);" o9 u& N2 a! H2 |; {* j2 S
  e.计算因颜色引起的发光量(mV)校正值ΔL=L1一L2;+ C. Y0 x  D; }5 f: h
  f.按5(3)⑦和5(3)⑧所述常规步骤测试带色样品管及其CK管(氯化钠3g/l00ml溶液)的发光量(mV)。所有CK管测得之发光量(mV)均须减去校正值ΔL(mV)后才能作为CK发光量(mV)。
' Q" w( t' K6 y6 W5 B  有色样品溶液测定干扰的校。
% r3 ^; ]/ l% u0 J1 b  6.质量保证与质量控制- P& N& @) p' S% Z% \# r
  ①每支发光菌的发光强度和稳定性不尽相同,同批样品测定过程中应使用同一支发光菌,如果需做 HgCl2标准曲线,也应与样品使用同一支发光菌。如果一支不够用,可采用同批的两支混合后使用。: W: M# d0 n# f* ?% G1 D
  ②上一般通用反应时间为5min或15min两种,鉴于我国目前所用发光杆菌的灵敏度和稳定性,采用15min。
* y$ d/ W) o# ~/ Z  ③三次重复测定结果相对偏差确定为≤1%。, i, Q( K8 m# N$ h* |+ j1 Z
  ④测定应在采集样品后立即进行,在6h内不能测定应低温保存,但不得超过24h。8 x- Q+ M6 E; E( M2 A
  ⑤关于样品如何稀释的问题,一般根据样品毒性大小决定,但是在试验中至少要选择六个不同浓度。如果六个浓度的相对发光度在1%-100%之外,可增配若干个浓度,使之落在1%-100%相对发光度范围内,以求相关方程。
- u& p& N- b+ D6 ^5 k, v% L; T  ⑥如果样品浓度为MAX高极限浓度(即100%)时,其相对发光率都不能使发光强度减少50%,则对样品的EC50值只能示为>100%。- y9 V3 o% X. N8 B# m6 P
  ⑦鉴于发光细菌法实验因素的影响,实验结果具有一定误差。在评价毒物的剂量一效应关系时,应确定95%置信区间,即T=a+bC±2SE(SE为剩余标准差),以此求出的EC50也有一定的区间,可根据这些结果确定实验结果的准确性和真实性。对于实验结果的重现性,就大多数而言,一般EC50值的变异系数在6%-10%。$ F- U3 i4 ?% E6 a( ^! S
  7.测试结果的表达3 m/ |- a) O! `% n) t7 A
  1)计算样品相对发光度(%),并算出平均值:
6 u! w! E5 u+ w2 [' j  相对发光度(%)= HgCl2管或样品管发光量(mV)/CK管发光量(mV)×1002 X5 r2 e7 u! T& c# e4 Y. Y/ u
  相对发光度(%)平均值=(重复1)(%)+(重复2)(%)+(重复3)(%)/3; h+ P6 H2 U! U7 O" J9 I; ?$ s
  2)符合5(1)①中样品母液相对发光度在1%以上者,建立并检验 HgCl2浓度(C)与其相对发光度(T,%)均值的相关方程,也可以绘制关系曲线。8 L8 b: p4 g! F  n+ h3 l7 c2 j5 t
  ①求出一元一次线性回归方程的a(截距)、b(斜率、回归系数)和r(相关系数),列出方程:
2 O$ Q0 ^0 d) D" X  T=a+bC HgCl2# }$ {$ E8 b! W3 s% u" m8 r5 H1 p
  查相关系数显著水平(P值)表,检验所求r值的显著水平。若P≤0.01,且EC50 HgCl2=0.lomg/L±0.02mg/L,则所求相关方程成立;反之,不能成立,必须重测系列 HgCl2浓度的发光量。 HgCl2溶液配制过夜者,必须重配后再测定。' J3 |9 S# t8 u) n
  ②也可以据建立的上述方程绘制关系曲线。即发光度为10%和90%,代入上式,求出相应的二个 HgCl2浓度,在常数坐标纸上,定出二点,画一直线,即为符合该方程的 HgCl2浓度与相对发光度的关系曲线。
: A$ {4 g! Z3 h/ q, G0 `: ^$ }  3)符合5(1)①中样品母液相对发光度低于50%乃至零,欲以EC50表示结果者,建立并检验样品稀释浓度(C)与其相对发光度(T)均值的相关方程,绘制关系曲线。
2 x- V* W# p0 k& {  按7之2)所述方法建立相关方程T=a+bC样,并检验相关系数r、显著水平(P值)。
8 _9 Y  u+ m1 A( U+ G! X" o  若P≤0.05,则所求相关方程成立;反之,不能成立,必须重测样品稀释系列浓度的发光量。: w/ w7 }9 x+ s0 g
  8.结果评价和报告
3 K: }( K2 z$ z8 R  (1)用 HgCl2浓度表达样品毒性
+ W5 U. k, c) I  1)适用的条件:符合条件(样品母液相对发光度>1%)并按7之2)建立了合格((P≤0.01、EC50 HgCl2=0.10mg/L±0.02mg/L)的 HgCl2浓度与其相对发光度相关方程者。- \, w- |9 X2 [: v$ \5 P0 _$ n- y
  2)表达方法:
' O- F# _' `/ K  ①将测得的样品相对发光度,代入7之2)的相关方程,求出与样品急性毒性相当的 HgCl2浓度(一般用mg/L)表示。0 q0 c3 t: z6 M' I& h8 M
  ②测试结果报告同时列举样品相对发光度及其相当的 HgCl2浓度值。* m$ _! G# a! P% G8 O
  3)适用性:适用于相对发光度在1%以上,特别是50%以上(即不可能出现EC50值)但低于100%(即仍有中、低水平毒性)的样品毒性测定。9 P4 Z) O( T$ C, W: Y, S4 A5 i
  (2)用EC50值表达样品毒性
1 O& |: H- U  O  1)适用的条件:符合条件(样品母液相对发光度低于50%乃至零)并按7之3)建立了合格(P≤0.01)的样品稀释液浓度与其相对发光度相关方程者。
/ X$ e7 z* ~( W; L& \  2)表达方法:
$ b& Q6 D  m* L+ ?. b! G9 _1 b  ①将T代入7之3)建立的相关方程,求出样品的EC50值。这里的EC50值以样品的稀释浓度(一般用百分浓度)表示。
7 e5 r5 f' b& @8 [$ X& J  ②测试结果报告列举样品的EC50值。
' u, }/ N) [, _  3)适用性:适用于相对发光度在50%以下,特别是零(即毒性水平较高或很高)的样品毒性测定,后者无法以相当的 HgCl2浓度表达毒性。
6 v" _7 x- D. u% |; @3 l' M5 a  (3)测定记录格式( L% o7 c7 n1 L. V% c
  (4)测定结果报告9 O$ e0 N, j6 ?3 `" V
  ①实验室室温。5 V9 P% s7 V2 A+ S1 H
  ②采样地点、日期、时间。
- d- ?/ V& y# u# E  ③ HgCl2浓度或样品稀释百分浓度与相对发光度的相关方程:. r& r4 E. ~/ v9 E; r. J
  T=a+bC' e6 \; {' g7 m8 P- W- E: y
  r= P≤ EC50 HgCl2= mg/L
# h) I% S, _4 S( }' L; F; K  L=a+bC a= b=! ~2 f- h5 i: t6 ^9 N
  回归方程 r= P<
4 y2 }7 V2 T1 L$ r5 E' B1 S$ X! {  ④样品EC50值(稀释百分浓度)或相对发光度(%)及相当的 HgCl2浓度(mg/L)。
1 H3 W- E. q. V% K转载自:化工仪器网
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