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引言8 F# a0 I- Y8 R+ E C3 h
深海冷渗沉积物拥有丰富多样的微生物种群，本次实验中研究了在6个冷渗点海底以下430 cm的沉积层中发现的39种丰富物种的种内多样性模式，从中收集68个沉积物样本的宏基因组数据。 ! V6 {# z& W9 V- \$ y
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沉积物样品跨越不同的深度和氧化还原条件，从含氧沉积物-水界面到缺氧层。
, z* U0 ^* w( t- W, \ 在宏基因组组装和宏基因组组装基因组(MAGs)的分离后，1261个物种水平的集群(1041个细菌和220个古细菌;根据建议的95%平均核苷酸一致性阈值(ANI)来划分物种。
8 x0 |7 W6 D) a 在这些生理和系统发育不同的种群中，在基因组水平上观察到不同的进化轨迹，通常同源重组率低，纯化选择强。
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9 V n* n. u1 K. S, b: ^* \+ @ 与甲烷(pmoA和mcrA)和硫酸盐(dsrA)代谢相关的功能基因在大多数被研究的物种中都处于强烈的净化选择之下。 2 G# z; ]6 R# s \+ [! N f
基因组及其mcrA和dsrA基因的种群内多样化是深度依赖的，并且在不同地点的沉积物柱氧化还原带中受到不同的选择压力。
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; i$ [$ P ~# H: U9 W 这些结果突出了深海冷渗极端环境中生态过程与关键细菌和古细菌进化之间的相互作用，揭示了海底生物圈中微生物的适应。 % j5 J( r2 N3 m3 I, }) t" p+ f
一、冷渗漏带来微生物群落遗传进化的特异性及推动作用7 K1 t j5 }" s' [
冷渗漏中的微生物群落可能比周围海洋沉积物中的微生物群落丰富几个数量级，这可能会影响微生物种群随时间的演变。 6 h: g' r( j. ^; N8 X
+ v( \) b( w* g n9 U4 z$ k6 F9 ? 与其他底栖生物环境相比，冷渗漏也具有独特的环境条件，影响着当地的生态、进化生物学、化学和地质学。
( O0 A) o. f6 _1 \5 B: ^ 渗漏流体富含烃类气体(主要是甲烷)和其他高能量烃类流体，通过促进微生物的生长、特化和适应。 3 ~% o9 D& `3 D. V W0 |& T+ }* m! \
4 Z( f' B5 Z {' ]9 O 基于遗传标记扩增子测序和基因组解析宏基因组学，大量研究揭示了沿不同冷渗点和沉积物深度古细菌和细菌谱系广泛的宏观多样性(即群落内种群多样性的度量)和微生物代谢多样性。 ; D2 k1 U$ x& }
研究结果包括发现各种谱系的古细菌厌氧甲烷营养菌(ANME)和硫酸盐还原细菌(SRB)作为共同营养聚集体，在缺氧沉积层中进行甲烷氧化和硫酸盐还原。
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在冷渗漏的上层含氧沉积层中，甲烷被好氧甲烷氧化细菌(MOB)消耗，主要来自甲基球菌目。 ! @9 T8 X( _2 m* `/ H6 T# i
传统的以培养为基础的方法在研究微生物种群的遗传变异方面具有重要作用，但往往不适用于海底生物圈的研究，因为海底生物圈中大多数微生物极难分离。 ; h1 ^6 D& [# s- w0 r6 z# N' A
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开创性的研究已经使用宏基因组数据来探索基本过程(自然选择、突变、遗传漂变和重组)在塑造几种典型海底栖息地微生物进化中的作用。
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对栖息在奥尔胡斯湾缺氧海底沉积物上部两米的微生物基因组变异的原位研究表明，基因组多样化和选择的速度不会随着沉积物年龄或深度而改变，这可能是由于能量限制和这种环境中的生长减少。
9 e |& w: [ W( \( p s 与非喷口沉积物相比，在两个地球化学特征不同的热液喷口场中，Sulfurovum和Methanothermococcus两种物种在选择压力上存在种群特异性差异(能量可用性和细胞丰度相对较高)。 - ^) ?. b' Y M+ T6 Y. `% E
0 r7 i0 w' K" \; [/ j6 {! k, O 冷渗沉积物具有富含碳氢化合物的能量和碳源的供应、深度上强的氧化还原带、丰富的电子供体(如硫化物和甲烷)以及频繁的流体交换，使这些环境中潜在的不寻常的微生物进化成为可能。 2 m. _- i7 z! o$ h( Q5 o% v
甲烷和硫循环细菌和古细菌是居住在冷渗沉积物生态系统中的微生物群落的关键角色。
+ J } _6 {( I+ l! m, s 尽管存在这些动态变化，但尚未对冷渗沉积微生物的进化史和选择压力进行直接研究，并且缺乏与甲烷和硫循环相关的关键功能基因的核苷酸变异的知识。 a4 H/ E: s# E0 g
% H/ x9 }3 r+ `& ~ 为了深入了解冷渗沉积物中微生物种群的进化轨迹，我们研究了68个冷渗沉积物样本的宏基因组数据，通过宏基因组短读比对来跟踪种群微多样性，并进行了面向微多样性的基因组比较。 / E4 J9 [1 \+ o% a1 e. O
本实验还通过分析物种间基因组变异，揭示了深海冷渗沉积物中微生物进化的深度和地点依赖趋势。 * h9 L& t6 j! p- ^. F. A$ [* B
微生物在梯度环境中的适应是一个高度动态和复杂的过程，涉及多种进化力量的相互作用。 % E2 ^) g; H4 B0 Q% t% ]8 E9 Z
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二、深海冷渗沉积物的宏基因组的组装和分组8 B1 |& j) t. ]- Y
通过修剪引物和适配器，并过滤掉工件和低质量读取，对末端原始读取进行质量控制。
6 q- t( O8 O: O# G C c 每个样本(n = 68)的过滤读数被单独组装，并汇集每个采样站，去除小于1000bp的Contigs。
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4 N/ H; u) \! \; F0 R. e' u 对于每个程序集，使用分箱模块对contigs进行分箱，并使用metaWRAP将其合并为最终的分箱集。 , F q* x" l; T7 q3 Z& C6 P0 ^5 o
获得的mag质量通过CheckM特定谱系工作流进行评估，估计至少完成50%且污染小于10%的mag得以保留。 # r# J1 q4 q9 G/ y3 ~6 i+ t
在每个种簇中选取基因组质量最高的1261个mag作为代表种，进一步构建系统进化树，验证PmoA、McrA(产甲烷或产甲烷)和DsrA(还原性或氧化性)的系统进化枝。 * w9 x$ `' I, N9 a# s
# R. @8 C4 [5 J( w) H' M2 W# e
为了构建三种功能蛋白的树，使用MEGA对氨基酸序列进行比对，所有站点覆盖率低于95%的位置都被排除在外。对于SNP调用，映射到该位置的质量过滤reads的数量必须至少为5倍的覆盖率和5%的SNP频率，而具有变异碱基的reads必须高于预期的测序错误率(1 × 10(−6))。 . [# q" A9 c; ~* T+ Z+ A% h, b( M4 e
为了评估测序覆盖度变化对SNVs/kbp的影响，我们分析了SNVs/kbp与所有基因组覆盖度之间的相关性，单独增加覆盖率并不能解释snv /kbp的巨大差异。
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G3 Q5 E0 l, L' M" ^& Q 三、冷渗沉积物中物种水平簇的深度分布
2 K9 |/ S. C" G, ^' y- p" l( ~; [7 s 1261个物种群分属85门(细菌70门，古菌15门)基于基因组分类数据库，主要为Chloroflexota (n = 184)、Proteobacteria (n = 125)、Desulfobacterota (n = 101)、plananctomycetota (n = 73)和Bacteroidota (n = 67)。 & E+ [' N$ n& Z$ i6 g9 h
排名前5位的古细菌门分别是Asgardarchaeota(50门)、Thermoplasmatota(44门)、Halobacteriota(42门)、Thermoproteota(35门);主要是深海古菌)和纳米古菌(n = 19)。 # F4 F: N9 m* x
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在85个恢复的门中，大多数在GTDB中缺乏可用的培养代表，并且完全由来自社区DNA的mag和来自环境样本细胞分选的单细胞扩增基因组(sag)组成。
! e, y8 Y! ~0 ^& y! T 大约51%和94%的恢复基因组簇分别不能分配给现有的属或种，证实冷渗漏微生物组主要由未培养的成员组成。 # G! O* P: U4 R; _5 Q& x9 |3 y
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在门级,总成员的相对丰度古门Halobacteriota最高在大多数沉积物深度跨样本,和范围从2.9±1.2%的表面(0 - 5 cmbsf;N = 10个样本)至20.7±7.3%的深层(200-300 cmbsf;n = 4个样本)。 + o& \7 s; ?4 x- r) |2 y
在物种水平上，ANME-1(属QEXZ01)群排名最高(在30至430 cmbsf的4个深度类别中高达9.6±2.8%)，其次是ANME-2c群(在0至30 cmbsf的4个深度类别中高达2.0±0.4%)，表明ANME古细菌在深度分布上存在差异。
$ w! H6 m0 n; _2 ` Desulfobacterota门和Caldatribacteriota门的细菌分类群也非常丰富，其中Caldatribacteriota门在较深的沉积物中尤为普遍。
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在物种水平上，细菌MAG最丰富的是Caldatribacteriota SB_S5_bin2，在100-200 cmbsf下的MAG值高达2.2±1.3% 。 9 N k/ D, f0 Q' Q* ^/ V7 K
ANME-1或ANME-2的潜在合作伙伴相对占优势(在200至450 cmbsf的两个深度类别中高达2.3±0.5%)。 ! l1 D6 j4 p" M3 A
这与最近基于16S rRNA基因和宏基因组测序观察到的冷渗微生物群落的深度依赖分布模式一致。 ) O; j& C/ g" l; O
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含有pmoA基因并通过MAG质量要求标准的三种γ变形杆菌属仅在南海海马冷渗的近地表沉积物(0-10 cmbsf)中被发现。
7 y& E( U7 j: ]' L 这13种物种代表了Methanosarcinaceae, HR1, ANME-2c和ANME-1家族水平谱系，并且广泛分布在深度为1至425 cmbsf的大多数渗漏沉积物样本中(68个样本中的53个)。 2 g$ J/ _. l. C1 [3 `! v
6 U+ f. z3 z2 l2 Z/ y7 L( G* O7 ^ 在Desulfobacterota中，共有23种细菌具有进行硫酸盐还原的潜力。
% o2 h, c3 N( D: k 这些SRB属于四个支系:“C00003060”(又名sepp - srb1c）、desulfoobacterales、Desulfobulbia和Desulfatiglandales，广泛分布在1-425 cmbsf的5个地点的冷渗沉积物柱中。
% `; J: P _- M2 v U+ q, D! z 进一步的系统发育分析表明，sepp - srb1c和Desulfobacterales中的16种SRB物种与之前报道的ANME分支(hotsep -1、sep - srb2、sep - srb1a和sep - srb1g)的典型合成型SRB伙伴紧密聚集(40,46,44,48)。以下简称合成SRB。
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在基因组水平上，对上述鉴定的39个物种水平的MOB、ANME和SRB进行了连锁不平衡(D )、全基因组中非同义突变与同义突变的比率(pN/pS)、同源重组引起的核苷酸取代与突变引起的核苷酸取代的比率(r/m, gamma/mu;(见方法)，以及每千个碱基对的单核苷酸变异数(SNVs/kbp)。
) Q, l S( q: B 这些进化指标在MOB、ANME和SRB种群中变化很大，显示出D (~0.89 vs 0.72-0.99 vs 0.74-0.99)、snv /kbp (5-41 vs 2-98 vs 2-89)和pN/pS (0.12-0.27 vs 0.11-0.25 vs 0.13-0.23)的分布范围很广。
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pN/pS结果表明，这些沉积冷渗种群处于净化选择中，这表明这些生物可能在相对稳定的环境中达到了适应性最佳，并通过清除非同音突变来维持这一状态。 9 V' N4 s+ S/ w! y2 E
除了ANME组的D′P = 0.06和两个世系之间的pN/pS P = 0.04外，ANME和SRB世系之间几乎所有的进化指标都有统计学上的显著差异(P < 0.001)。
7 v1 O2 h: w4 z. g7 W7 \3 D8 O0 K 与ANME和其他SRB组相比，ANME的合养SRB伴侣显示出更低的snv /kbp和更高的pN/pS值。 1 |& @5 h8 X( a% ^* s, p" X" ^' C! O
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R /m比值可用于衡量同源重组对群体遗传多样性的相对影响，这表明ANME和SRB群体通过提高重组率来保持高全基因组多样性，以防止潜在环境变化带来的全基因组选择性扫描。 & _/ x: o) C0 v: B: B
Methanosarcinaceae的snv /kbp与pN/pS以及D′呈负相关，表明该种群通过频繁的重组保持稳定，同时保持高度的种群内多样性和同音突变的积累或非同音突变的去除。
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对于来自ANME-2c的UBA203、来自HR1的UBA7939、来自Desulfobacterales和desulfurvibrionaceae的UBA7939、来自JACNLL01的B13-G4群体，基因组覆盖度(即群体的相对丰度)和SNVs/kbp符合正斜率线性回归模型，表明群体规模对基因组微多样性有重要影响。 " Q$ U1 X [) d. A6 N1 b& E
对于JACNLL01，高覆盖群体也表现出相对较高的重组程度，但这与氨基酸序列的变化无关，尽管核苷酸变化很大。 % o, b* Q5 }4 r& H
; c5 g V: T: d( U* e& n9 g QENH01和UBA7939群体丰度越高，重组率越高(线性回归;R(2) = 0.44, R(2) = 0.20, P < 0.001)，符合r/m与覆盖率的正线性回归(线性回归;R(2) = 0.81, p < 0.001)。 ; X5 `+ a* o( j6 }
snv /kbp和pN/pS在mcrA和dsrA基因之间存在统计学差异(P < 0.001)，与其他SRB组相比，来自ANME典型同养性SRB伴侣的dsrA基因具有更高的snv /kbp和主要等位基因频率，而pN/pS值相似。
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% e d6 N; G, S& d' `# f 从pN/pS值(0 ~ 1.43，平均0.16)来看，pmoA、mcrA和dsrA基因处于强净化选择状态。这三个关键功能基因的进化适应度与先前对天然的comammox硝化螺旋菌群体(49)和从数百万年前的海底沉积物中分离的Thalassospira细菌群体的研究结果一致。
; e/ c7 @- R( L. ?* K2 r" ]7 q: i 尽管MOB、ANME和SRB埋在海底，那里的微生物进化可能与阳光照射的栖息地不同，但pN/pS的分布剖面与中性理论一致，其中大多数突变事件是中性的或有害的。 0 w7 p9 r7 ?, W6 Q8 N' \
; C9 V0 N; w; Q( F) k/ u" n" u
在ANME-1组中，来自系统发育相关的QENH01群体(HMR20_21和HMR2_5)的mcrA基因具有较高的pN/pS值和较低的同义突变率，表明正选择或放松纯化选择。
x" v9 l/ _4 g. M& U 对于来自ANME-2c的mcrA基因，SNVs/kbp(线性回归;R(2) = 0.47, P < 0.001)和pN/pS值(线性回归;R(2) = 0.17, P = 0.003)与基因覆盖率呈正相关。
; H& g0 |; r, ?7 Y& W c+ O 来自Desulfobulbia、sepp - srb1c和Desulfatiglandales的dsrA基因的进化趋势(相对较低的SNVs/kbp和pN/pS值)相似)，表明这些dsrA基因在纯化选择后功能稳定。 " b% t3 U% `' n! {
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在Desulfobacterales组中，dsrA基因的pN/pS值也较低(~0.12)，但SNVs/kbp范围较宽。在一个例子中，ETH-SRB1 SB_S7_bin23群体的dsrA基因表现出异常高的pN/pS值，同义突变较少)，表明这些dsrA基因受到强烈的正选择，并可能进一步受到遗传漂变的影响。 3 l) D9 Z) v& ^
mcrA和dsrA基因的主要等位基因频率(平均0.79)似乎与SNVs/kbp有直接关系。
7 |4 h* I) C) ?" }+ I; [ 高snv /kbp对应着相对集中的高主等位基因频率(~0.8)和高覆盖度，而低snv /kbp时主等位基因频率分布多为分散(0.56 ~ 0.99)。
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大多数mcrA和dsrA基因的特异性主等位基因固定在不同程度的核苷酸多样性(SNVs/kbp, 1-123)上(主等位基因频率为0.70-0.98)。
8 s9 B A. v; j4 f4 H 对于主等位基因频率相对较低(0.56-0.70)和pN/pS值较低(0-0.26)的mcrA和dsrA基因，在HR1、SEEP-SRB1c、Desulfobulbia和Desulfobacterales群体中保留并强烈选择了遗传异质性，这可能有助于不同环境条件下功能基因的多样化。 8 N' ], Z0 N& K$ C5 |- i4 R$ r& \& r% S
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这种与深度相关的趋势不同于在非渗漏的海洋沉积物中观察到的情况，在非渗漏的海洋沉积物中，无论沉积物深度如何，埋藏的微生物种群都表现出一致的低遗传异质性。 . f$ n' \- ?% D' g! A. J
冷渗沉积物中的进化分层与地球表面的远洋淡水环境中的结果相似，后者在水柱深处的突变率比在湖泊的地表水中要低。
$ a7 N6 n; C4 y# G0 E2 N 这可能与冷渗漏沉积物中较高的能量供应和较大的种群规模有关，相比之下，大多数海底缺乏来自下面的高能流体的涌入。 ; X* C7 X" t" ?, f" q% D
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mcrA和dsrA基因的深度依赖微多样性模式也被观察到，在大多数种群中，SNVs/kbp和pN/pS与沉积物深度呈负相关，而主要等位基因频率则以种群或位点特异性的方式与深度呈正相关或负相关。
5 F4 Y) N& |; Q5 h k" { 对于来自ANME-1的QEXZ01，核苷酸多样性和同源重组与SB位点深度呈正相关;desulfurvibrionaceae的SNVs/kbp和desulfatiglaceae的pN/pS分别与HM位点深度呈负相关。
; c( @, u1 @, B, [5 F- L; P
- v# ~, b* u+ x' r 对于三个关键功能微生物群，基因组水平的进化指标(D ， SNVs/kbp, pN/pS)在不同的冷渗位点之间显示出显著差异(P < 0.001) 。
/ o3 \' q# H0 d, h! @: Z 不同冷渗地点的物化条件也影响种群内多样性和进化过程，三种功能基因在不同冷渗位点的进化指标(SNVs/kbp和主要等位基因频率)也存在差异(P < 0.01) 。 # t3 G2 d: ^# S. I& f) h
% I1 a: u9 a$ Z' [( V 功能基因存在位点依赖性微多样性，pmoA、mcrA和dsrA基因之间的pN/pS没有明显差异。
2 V! B) f8 E+ A3 j' n* Z% F7 { 这表明这些来自MOB、ANME和SRB的关键基因在不同的冷渗位点上大多是功能保守的。 ; I$ d% Q5 `% [; N
总结 Y" m! w0 g9 r' v. U: h2 F6 w
冷渗沉积物中的微生物进化是复杂的，受不同于影响底栖生物其他部分的因素的控制，包括能量有限的海洋沉积物、热液喷口和低生物量的海底流体。
m& \' B. |! v+ m+ U& i! ^ ( w+ H$ ?9 {/ @( {. E5 {$ X
冷渗沉积物中甲烷营养化和硫酸盐还原种群表现出不同的进化模式，核苷酸变异程度不同，同源重组程度不同，表明富含甲烷的烃类流体所施加的选择压力以不同的方式影响着不同的种群。
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MOB、ANME和SRB的物种通常经历低同源重组和强净化选择，后者在甲烷(pmoA和mcrA)和硫酸盐(dsrA)代谢相关的功能基因中表现得尤为明显。 3 Z2 U4 d" |+ C: b+ C
这些基因揭示的进化指标在物种之间存在差异，但在全球不同的冷渗生态系统中在地理上功能上是保守的，这支持了相对稳定的环境参数(即甲烷和硫酸盐的持续供应)的重要性。 ( H- b1 [( h1 T) H( z9 N
$ ^0 P5 p1 i* T* c& v/ [ 沉积物深度不仅塑造了冷渗沉积物微生物群落结构，也是微生物基因和基因组中观察到的种内微多样性的决定因素。
$ m5 B2 z$ o% r- K; [ 微多样性的深度依赖趋势似乎是氧化还原条件和沉积物年龄变化的结果，这些观察结果提高了我们对在最独特的海底栖息地之一中驱动缓慢生长的深海微生物进化的原理的理解。
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